活體單細胞顯微技術成像可實時表征基于單細胞水平的生理變化，有助于揭示組織間的信號傳輸機制和細胞相互作用，對于預測和調控疾病進展至關重要的。然而，基于傳統的可見和近紅外光（NIR-I，<900 nm）顯微成像面臨嚴重的光衰減問題，活體顯微通常需要在成像部位進行手術以暴露目的組織。然而這種手術開窗輔助成像不可避免地會改變局部血管通透性，誘發皮膚、肌肉或顱骨等組織炎癥，誘發成像區域組織的微環境變化。

為此，復旦大學張凡教授研究團隊率先開發了基于近紅外第二窗口熒光（NIR-II，~1500 nm）的活體無創顯微技術。張凡教授最新發表的Nature Protocols論文詳細介紹了如何利用NIR-II納米熒光探針進行活體顯微成像，以避免在活體組織中的衰減，從而實現對深腦組織中的單細胞動態追蹤，采用光學性能優異的稀土納米探針ErNPs和TmNPs標記活體中的中性粒細胞，實現了對腦卒中小鼠腦皮層中中性粒細胞無創動態可視化和遷移行為分析。在這篇文章中，研究團隊詳細介紹了NIR-II顯微成像用于活體動態細胞追蹤的實驗方案（圖1），從NIR-II納米熒光探針的設計合成與表征，多通道NIR-II顯微成像設備的靈活搭建，活體標記細胞，NIR-II活體顯微成像實驗的前期準備與實時成像操作，數據分析等多方面進行了詳細的介紹。

圖1. 近紅外二區活體熒光顯微成像技術的工作示意圖

其中，團隊利用開發的新型近紅外二區稀土熒光探針特異性的標記了小鼠的中性粒細胞以研究炎癥血管中活化中性粒細胞的體內成像（圖2）。中性粒細胞能夠在血管內壁爬行到外滲部位，然后外滲是中性粒細胞活化的典型特征。CD11b是一種介導細胞粘附和遷移的中性粒細胞表面蛋白，在活化的中性粒細胞表面表達上調。中性粒細胞上Ly6G和CD11b蛋白的雙重標記有助于在體內特異性地跟蹤活化的中性粒細胞。因此，在缺血性腦卒中小鼠模型中，靜脈注射抗ly6g抗體偶聯的α-TmNPs和抗cd11b抗體偶聯的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)，標記活化的中性粒細胞，雙標記的中性粒細胞表現出微弱的運動、滾動和爬行，表明它們在內皮細胞表面粘附牢固。此外，可以觀察到雙標記的中性粒細胞，沿著血流的剪切力被拉長，這通常被認為是中性粒細胞通過炎癥血管外滲的最后一步。

圖2. 炎癥血管中活化中性粒細胞的體內成像。

最后，本文對基于NIR-II熒光活體顯微設備和技術的適用范圍和應用前景進行了總結與展望，致力于將NIR-II熒光顯微技術推廣于腦科學、感染科學、免疫與炎癥、腫瘤、干細胞等生物醫學科學的基礎研究應用中。

參考文獻

Ying Chen, Yiwei Yang, and Fan Zhang*. Noninvasive In Vivo Microscopy of Single Neutrophils In The Mouse Brain Via NIR-II Fluorescent Nanomaterials. Nature Protocols, 2024. DOI: doi.org/10.1038/s41596-024-00983-3.